2024年4月16日，威尼斯87978797地理与海洋学院、福建省海洋生物多样性保护与永续利用重点实验室潘铖烺团队研究发现miR397调控秋茄根外皮层木质素聚合响应镉胁迫，相关成果以“miR397 regulates cadmium stress response by coordinating lignin polymerization in the root exodermis in Kandelia obovata”为题发表于国际主流期刊Journal of Hazardous Materials。
研究亮点
• 首次从根系外皮层木质素化学组成角度解析不同发育阶段秋茄根系对镉胁迫的不同响应。
• 通过MicroRNA锁定其靶基因在秋茄根外皮层的差异表达，拓展对植物漆酶生物学功能的认知。
• 揭示miR397在秋茄镉胁迫过程中对漆酶的靶向调控。
研究进展与内容
红树植物秋茄（Kandelia obovata）根外皮的次生木质化对其应对高盐度和厌氧环境等逆境至关重要，这种木质化还能有效阻止镉向根部的迁移。然而，不同发育阶段根外皮木质化对镉胁迫的响应差异及其调控机制尚未揭示。该研究利用扫描电镜和能量色散X 射线光谱分析了根的结构和细胞壁厚度，并测定了根细胞壁中的镉含量，发现幼根和成熟根的外皮层通过不同木质素单体的聚合对镉胁迫做出不同响应：形成束缚和阻档两种机制。通过小RNA测序、RLM-5’-RACE和双荧光素酶瞬时表达系统，明确了miR397对KoLAC4/17/7的靶向调控。KoLAC4/17的表达促进了木质化过程中愈创木酚的积累，增强了镉与细胞壁的结合。同时，KoLAC7的表达促进了木质化过程中丁香基木质素的积累，增强了对镉的阻碍作用，提高了对镉的耐受性。
图文摘要
该研究利用扫描电镜和能量色散X 射线光谱观察到成熟根的外皮细胞比幼根的外皮细胞排列更紧密（图1）。此外，在长期（15天）的镉胁迫下，成熟根的外皮细胞壁可见木质素积累（图1），细胞壁在镉胁迫下明显增厚（图2A）。此外，作者发现在长期镉胁迫下，幼根外皮细胞壁的镉含量是成熟根的两倍（图2B）。进一步测定幼根和成熟根不同组织的细胞壁镉含量后发现，幼根外皮层细胞壁的镉结合能力高于其他组织，说明在长期镉胁迫下，幼根对镉的束缚作用强于成熟根（图2C）。另外，对根外皮层木质素单体组成的分析表明，在镉胁迫下幼根外皮中愈创木基（G）的含量显著增加。同时，在成熟根中，镉胁迫后丁香基（S）的含量明显增加（图2D）。
图1 镉胁迫下K.obovata幼根和成熟根外皮的结构观察
（A）利用Phenom 扫描电子显微镜（SEM-EDX，Phenom ProX）选取K. obovata的幼根和成熟根（直径5-10毫米，距根尖4-8厘米），并通过能量色散X 射线光谱进行观察。红色框内区域表示幼根和成熟根外皮细胞排列的形态差异。（EX：外皮层；CO：皮层）（B）白色箭头表示镉胁迫后根外胚层细胞壁增厚，木质素在细胞壁中积累。
图2秋茄根外皮细胞壁厚度、细胞壁中镉浓度的测定和木质素单体的分析
（A）用0 μM CdCl2（CK）或100 μM CdCl2处理15天的秋茄幼根和成熟根。（B）分别对处理的根系进行细胞壁提取，并通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS，Agilent 7500cx）测定镉浓度。（C）将幼嫩和成熟的根分为外皮、皮层和茎，分析根不同组织细胞壁中的镉含量。（D）评估幼根和成熟根外皮细胞壁中不同木质素单体对镉胁迫的反应。*表示数值差异显著（P<0.05）。（YR：幼根；MR：成熟根）
通过小RNA测序和靶基因预测分析，作者鉴定了miR397及其漆酶基因成员在秋茄根外皮层不同发育阶段的表达差异（图3）。通过RLM-5'-RACE和双荧光素酶系统验证了miR397靶向KoLAC4/7/17（图4）。同时，荧光定量结果也证实miR397与KoLAC4/7/17在秋茄根系不同组织表达的负相关性（图4-5）。
图3秋茄根外皮层对镉和小RNA测序和miRNA靶标的GO分析
（A）图中显示了分别用0（CK）或100 μMCdCl2处理3天和15天的秋茄幼根和成熟根。（B）韦恩图显示了不同组间差异表达的miRNA数量。（C）所有预测的靶标都与GO数据库中的GO术语进行了映射。
图4 miR397靶标位点分析和表达量验证
（A）利用RLM-5'-RACE 确定靶标位点。图中显示了目标mRNA序列和成熟miRNA序列。垂直箭头表示5'-RACE确定的miRNA介导的裂解产物的5'端，并显示克隆的频率。（B）双荧光素酶瞬时表达系统也用于检测miRNA与靶基因之间的调控。（C）镉胁迫下miR397在秋茄幼根和成熟根不同组织中的表达量测定。星号表示数值差异显著（P<0.05）。
图5漆酶基因在根系不同组织中的表达量测定
（A-C）采用qRT-PCR测定漆酶在根系不同组织的表达量。将镉处理后的幼根和成熟的秋茄根分为外皮、皮层和根茎，以评估目标基因的表达。以肌动蛋白作为参考基因。表达水平用2-△△Ct法计算。进行了三次生物重复和三次技术重复。*表示数值差异显著（P<0.05）。作者通过外源转化本氏烟草，初步证实过表达KoLAC4和KoLAC17可以显著增加木质素G单体的含量，而过表达KoLAC7可促进S型木质素单体的增加，且这个增加趋势在镉处理后更显著（图6）。
作者通过外源转化本氏烟草，初步证实过表达KoLAC4和KoLAC17可以显著增加木质素G单体的含量，而过表达KoLAC7可促进S型木质素单体的增加，且这个增加趋势在镉处理后更显著（图6）。
图6 Cd处理下转基因烟草植株的形态结构观察和木质素含量
（A）收集镉处理后60天烟草幼苗的根，用扫描电镜观测维管束组织细胞壁厚度。（B）从幼根外皮中提取细胞壁，用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS，Agilent 7500cx）测定镉浓度。（C-D）根木质素含量和木质素单体成分比分析。
作者推测，在幼根的外皮层中细胞壁镉结合能力的增加与G木质素含量的增加相对应。换句话说，G木质素含量的增加提高了木质素聚合过程中的镉结合官能团（如羟基）占比，提高了细胞壁的镉结合能力（图7）。而成熟根的外皮中S木质素含量较高，同时镉胁迫加速了木质素的增厚，有效延缓了根对镉的吸收，但S单体的积累与木质素增厚之间的联系尚不清楚。
该研究结果拓宽了人们对红树林中漆酶生物功能的认识，也为今后提高红树林重金属耐受性的研究提供了科学理论依据。
图7提高幼根细胞壁镉结合能力的假定机制
在幼根的外皮层，木质素聚合过程中G单体含量的增加会改变木质素结构中GCHOH/GCHO的比例和羟基等官能团的数量，从而增加木质素聚合过程中的镉结合官能团（如羟基），提高细胞壁的镉结合能力。
第一作者：潘铖烺、张明雄
通讯作者：潘铖烺
图文来源：潘铖烺
论文来源及链接：
Chenglang Pan#*, Mingxiong Zhang#, Jianming Chen, Haoliang Lu, Xuemei Zhao, Xiaofeng Chen, Lu Wang, Pingping Guo, Shuyu Liu. miR397 regulates cadmium stress response by coordinating lignin polymerization in the root exodermis in Kandelia obovate. Journal of Hazardous Materials, 2024, 471: 134313. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.134313